JIP-test荧光参数PCA分析实操

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植物材料&处理方法(Material andmethods)

选用紫薇（Lagerstroemia indica Linn.）长势均匀、朝向一致的成熟叶，60℃热水分别浸没0s、10s、30s和60s热胁迫处理。

快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP polyphasic chlorophyll Chl a fluorescence rise kinetics)

使用Handy PEA(Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK)测定，时长2s，光强3000 μmol·m^–2·s^–1。测定前所有样品由暗适应夹遮光处理30min。依据JIP-test能量流动模型理论(Strasser et al. 2004)荧光参数由PEA Plus软件直接计算并导出。

根据Springer Nature 2018出版的《Advances in Plant Ecophysiology Techniques》归类总结的热胁迫对快速Chl荧光(OJIP)参数的影响(点击这里阅读此文)选择相应敏感参数进行PCA分析，所选JIP-test荧光参数介绍详见文末附表1。

数据分析软件(Statistical analysis)

数据PCA分析处理及作图分别使用IBM SPSS Statistics 26(IBM Corp)和Excel 2016(Microsoft Corp)。

操作步骤(Operation Steps)

一、    原始数据的导出&预处理

样品测定结束后，通过PEA Plus软件对样品数据进行分组预处理、导出并标准化处理OJIP曲线和导出JIP-test荧光参数，详细操作方法点击这里查看视频教程。

二、PCA主成分分析操作步骤

1. 将JIP-test荧光数据导入SPSS软件后，如上图点击工具栏“分析”→“降维”→“因子”，弹出PCA分析设置对话框。

2. 如下图，将选定的需要进行PCA分析的JIP-test荧光参数导入至“变量”栏中。

3. 点击“描述”，选中“KMO和巴特利特球形度检验”：使用主成分分析进行信息浓缩研究，首先应分析研究数据是否适合进行主成分分析。

(i)分析KMO值：如果此值高于0.8，则说明所选数据非常适合进行PCA分析；如果此值介于0.7~0.8之间，则说明比较适合进行PCA分析；如果此值介于0.6~0.7，则说明可以进行PCA分析；如果此值小于0.6，说明不适合进行PCA分析；

(ii)如果Bartlett检验对应p值小于0.05也说明适合进行主成分分析。

4. 点击“提取”，选择显示“碎石图”，提取“因子的固定数目”为2。

碎石图用于辅助判断主成分提取个数，当折线由陡峭突然变得平稳时，陡峭到平稳对应的主成分个数即为参考提取主成分个数。

碎石图仅辅助决策主成分个数，实际研究中更多以专业知识，结合主成分与研究项对应关系情况，综合权衡判断得出主成分个数，此处我们选择提取的主成分个数即“因子的固定数目”为2。

5. 点击“旋转”，选择旋转方法为“最大方差法”，并选择显示“载荷图”。

使用最大方差法使得降维后同一纬度的方差最大且不同维度之间的相关性为0，而载荷图用于展示各成分与载荷值关系情况或各成分再不同维度上的分布情况。

6. 点击“得分”，选择因子得分"保存为变量"，并“显示因子得分系数矩阵”

通过因子得分系数，分析出各JIP-test荧光参数与各主成分因子(PC1&PC2)的对应关系或相关性情况。7. 点击“选项”，选择系数显示格式“禁止显示小系数”且绝对值为0。设置绝对值为0可显示全部因子得分系数，可用于后续聚类分析处理。8. 点击“确定”即可得出PCA分析结果。

三、PCA主成分分析结果查验

1. 弹出PCA分析结果查看器后，首先如下图查看“KMO值”(＞0.6)和“巴特利特球形度检验显著性p值”(＜0.05)是否符合PCA分析要求。

2. 查看PCA提取因子PC1&PC2对所有参数的提取分离度，如下图PC1和PC2对所有参与分析参数的累积分离度分别为59.643%和32.042%，PC1&PC2共同的累积分离度为91.685%，表明经PCA处理分析得到的两个成分因子可对所选参数有极佳的分离描述度。同时通过“碎石图”可更直观的查看各成分因子(PC1、PC2...)对参数的累计分离度。

3. 初步预览所选JIP-test参数“旋转后的成分矩阵”以及在由PC1&PC2组成的二维平面上的分布情况。该成分矩阵表用于后期参数分布图的制图。

4. 返回“数据编辑器”预览经PCA分析后新生成保存的各样品“主成分因子得分表"，表明各样品在PC1&PC2的得分情况，该得分表用于后续所有测定样品的聚类分析。

四、PCA主成分分析结果的可视化操作

n  聚类分析——样品和JIP-test参数主成分聚类分析的可视化

将所有样品“主成分因子得分表”和JIP-test参数“旋转后的成分矩阵”复制至新建Excel表中。

1. 选中同一处理组样品的PC1&PC2得分，点击”插入“→”散点图“。

2. 在新生成散点图处，点击鼠标右键→点击”选择数据“→分别设置各处理组系列名称及X轴、Y轴对应数据，详细操作见下方视频。

3. JIP-test参数在主成分坐标系中的分布同样品聚类分析操作类似，选中所有参数PC1&PC2得分插入散点图即可。

详细操作步骤请查看本试验下方教程视频：

n  参数分布变化——单一处理组JIP-test参数主成分分布可视化

除将所有处理组共同聚类分析外，如下图还可将不同处理组JIP-test参数分布变化进行对比。

1. 在SPSS软件中将不同处理组样品参数分别进行PCA主成分分析。

2. 获得单一处理组PCA分析结果后，将该组JIP-test参数“旋转后的成分矩阵”复制到Excel中。

3. 为获得每一参数点箭头指示连接符，需将各JIP-test参数在坐标系中的位点转换为向量值。

4. 在每一参数上部添加一空白行，并输入原点"0"。

5. 选中单一参数数据，插入散点图，分别设置X轴&Y轴坐标为连接原点的向量值。以新系列形式逐一添加所有参数至散点图中。

6. 设置箭头颜色、样式，隐藏数据点，添加系列标签，标记分簇即可。

单一处理组JIP-test参数主成分分布可视化详细操作教程见下方视频：

结果分析(Result)

通过PCA技术分析发现，所选的JIP-test参数形成了三个较好分离的簇。其中两个位于PC1(Cluster 1&3)上，一个位于PC2(Cluster 2)上。每一组参数描述了不同的生理过程：光能捕获和传递阶段(Cluster 1)、电子传递链末端性能(Cluster 2)和耗散阶段(Cluster 3)。PC1对应PSII活性，较高的值表示更高的PSⅡ性能(低光吸收、高光化学和电子传输效率)，代表参数包括Fv/Fm、PIABS、ABS/RC、DIo/CSm等；PC2则对应PSⅠ活性，较高的值表明PSⅠ性能较高，代表参数包括φRo、δRo、REo/RC等。

对实验对照和处理进行聚类分析发现，对照集中在Cluster1附近，随着胁迫程度的加深，聚类的位置也在发生改变：10s处理位于Cluster1和Cluster2之间，30s处理位于Cluster2和Cluster3之间，60s处理位于Cluster3附近。

结合参数分析，对照表现出较高的PS2性能，10s处理的PS2性能出现受损，30s处理则表现出较低的PS2性能和较高的PSⅠ性能，60s处理的PSⅠ和PSⅡ性能表现最差。

以上分析说明，高温处理较短时间会损伤PSⅡ的性能，但是PSⅠ的性能会相对提高；时间过长，PSⅠ和PSⅡ性能都会被破坏。

如下两图为对照组和高温处理后，被测参数主成分分布关系的变化。对照实验中，Fv/Fm、PIABS、ETo/CSm等光系统PSⅡ性能相关参数聚集在PC2上；φRo、δRo、REo/CSm等光系统PSI相关参数则在PC1上；ABS/RC、Mo、Wk三个参数成簇，位于PC1上；DIo/CSm近乎在原点。

60s高温处理后，PSⅡ相关参数转移到PC1上，PSⅠ相关参数转移到PC2上，ABS/RC、Mo与DIo/CSm聚集成簇，Wk转移到PC2上。

以上变化表明，高温处理主要影响PSⅡ的性能，ABS/RC、Mo与DIo/CSm则减弱高温处理的影响，ABS/RC代表光捕获，Mo代表能量传递，DIo/CSm代表耗散，这三个参数越大，代表样品的耐热性越强。

另附上热处理紫薇OKJIP曲线，详细制图方法本文不再详细介绍，可点击下面链接查看详细视频教程。

[研究方法]|PEA植物效率分析仪数据处理方法（视频）

附表1. 热胁迫JIP-test荧光参数PCA分析所选参数