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棒曲霉素PAT作为天然新型PSII抑制剂的作用模式


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化学除草剂广泛应用于农业等领域，但其对人体健康的危害日益受到人们的关注。此外，抗除草剂杂草的广泛蔓延，降低了作物的质量和产量。因此，寻找更广泛的生物除草剂资源，且毒性低、结构新颖、靶标独特、环境友好成为迫切需要研究的课题。

与传统的化学除草剂防治相比，生物防治在杂草防治中发挥着重要作用。天然化合物的开发是生物除草剂开发的重要途径之一。本研究旨在阐明棒曲霉素PAT的植物毒性，并揭示其作为一种新的天然光系统II (PSII)抑制剂的作用方式。

PAT对多种植物的毒性研究

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如上图，62种植物中43种对PAT表现出良好的敏感性，特别是菊科和禾本科杂草。另外，PAT处理后8种植物，包括4种作物(O. sativa, T. aestivum, Morus alba,& G. barbadense)属于叶片坏死损伤1~10 mm2的低感植物，因此PAT在杂草控制方面具有广泛的用途，是一种具有开发潜力的生物除草剂，可用于防治玉米地的外来杂草和阔叶杂草。

液相氧电极分段式测定电子传递链活性定位PAT抑制PSII电子传递链位点

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如下图，为了验证PAT在植物光合系统中方的作用位点，根据Coombs等[1]报道的液相氧电极（Hansatech Instruments Ltd Oxygen Electrode Measurement Systems）分段式检测方法，通过在叶绿体类囊体膜中添加人工电子供体和电子受体的方法，将电子传递链分为五个阶段分别检测其放氧活性。

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类囊体膜与不同浓度PAT孵化30min后，测定不同阶段的放氧活性，如下图A，其中表征由H2O至PSI的整体电子传递链活性的1阶段(H2O → MV)、表征PSII活性（含DCMU敏感位点）的3阶段(H2O → phenylenediamine)和表征PSII&PSI整体活性（除放氧复合体外）的5阶段(DPC → MV)，此三阶段处理的放氧速率均表现出浓度依赖性的显著下降。

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而表征PSI活性（不含DCMU敏感位点）的2阶段和表征PSII活性（不含DCMU敏感位点）的4阶段处理未发生显著性变化。
以上结果表明PAT抑制了PSII的电子传递，导致整个电子传递活性降低。此外，PAT不影响PSI和PSII供体侧的电子转移活性。说明PAT的作用位点刚好在PSII受体侧，与除草剂DCMU的作用位点相似。

荧光上升动力学OJIP曲线的分析

为了进一步准确地探测PAT对PSII的作用位点，作者测定了PAT和DCMU处理的紫茎泽兰叶片的荧光上升OJIP曲线。

如下图，100μM DCMU处理出现了典型的J阶跃升，荧光值在J-step快速达到与Fm相同的水平。J阶的跃升是由于PSII反应中心QA-的大量积而导致QA后的电子传递受阻导致[2,3]。

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PAT处理的最大荧光值Fm明显降低，I-和P-相随之处理浓度和时间的增加逐渐消失。这一现象与Gliotoxin处理相似，J阶的跃升和Fm值的下降，表明gliotoxin不仅阻断了QA后的电子传递，且对PSII天线色素的功能和结构产生了破坏[4]。此外，β-Lactone处理样品出现Fm的明显下降是由于它抑制了P680至QA的电子传递[5]。

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如上图为了研究PAT对荧光上升动力学性质的详细内在影响，对每条OJIP曲线Fo~Fm进行双重标准化得到可变荧光Vt = (Ft−Fo)/(Fm−Fo) （上图C上部）和相对可变荧光ΔVt = Vt(treated)− Vt(control)。

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上图C可见，与DCMU处理类似，PAT对荧光上升动力学的主要影响是J峰的显著增加。此外如图D，PAT略微降低了K-step。已知K-step的出现与放氧复合体（OEC）的活性有关，K-step或ΔK峰振幅的增加反映了OEC损伤的程度[2,6,7]。在这里，PAT对K-step的振幅有负面影响(上图D)，且导致OEC中心的活性分数略有增加(下图D)。表明PAT对OEC的活性有轻微的刺激作用。

JIP-test分析

JIP-test是分析荧光上升动力学OJIP曲线的有力工具，可以量化PSII在不同胁迫下的行为[2]。

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增加PAT浓度对Fo几乎没有影响，但显著降低Fm值。暗适应叶片Fo值代表叶绿素天线色素的性能[8]。Fm的下降可能是由于PQ库的氧化或PSII天线色素结构和功能的破坏导致[9]。
VJ的快速增加表明PAT阻断了QA之后的PSII电子传递。同时φEo和ψEo的显著降低也证实了这一点。φEo是PSII电子传递的量子产率，而ψEo则反应了捕获光子后电子传递至QA后电子传递链中的概率[2]。
 φPo（同Fv/Fm）也发生显著性下降，表明PAT处理同时也抑制了PSII原初光化学反应的最大量子效率。

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如上图D，由于PAT中断了QA至QB的PSII电子流，预计会发生PSII反应中心失活事件。QA- reducing centers的快速下降表明PAT确实导致了PSII反应中心的快速关闭。QA还原中心的明显减少必然导致非QA还原中心的增加，这些非QA还原中心也称为热沉中心(heat sink centers)，导致ROS的生成[2,10]。
荧光参数RJ表示QB位点被PSII抑制剂分子填充的PSII反应中心的数量[2,11]。PAT结合QB位点的PSII反应中心数量呈近似浓度依赖性的增加，因此，作者认为PAT引起的PSII反应中心失活可能是PAT与D1蛋白结合的结果。

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见上图，不同浓度PAT处理与ABS/CSm或TRo/CSm之间存在线性关系，这说明Fm的降低主要是由于ABS/ CSm或TRo/CSm值的降低。表明PAT不仅降低了叶绿素的浓度，而且破坏了天线色素组件的构象，降低了天线色素分子之间以及从这些分子到PSII反应中心的光能转移效率。这可能是由于PSII结构的氧化损伤产生ROS。

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PIABS作为对各种胁迫最敏感的JIP-test参数，表达了PSII的总体光合活性。叶片暴露于PAT后，PIABS表现出明显的浓度依赖性下降。此外，不同浓度PAT存在时，PIABS与φEo或 QA- reducing centers之间存在高度的线性相关关系(上图)。这表明PAT引起的PSII电子传递受阻导致QA还原中心失活是PSII整体光合活性丧失的主要主导因素。
综上所述，PAT主要靶向D1蛋白的QB位点，在受体侧阻断PSII电子传递。
PAT与D1蛋白互作建模

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PAT结合QB位点的分子相互作用模型表明，D1蛋白中的His252残基通过形成氢键为PAT的O2羰基氧原子提供了一个关键配体。这不同于经典的PSII除草剂和天然的PSII抑制剂。
因此，PAT是一种新型的天然光合抑制剂，可以设计和组装具有更强除草剂活性的衍生物，具有开发成生物除草剂或作为模板支架发现具有更强除草剂活性的新衍生物的潜力。但PAT的准确结合环境还需通过晶体学数据和突变体实验进一步验证。

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专业致力于生命科学、植物生理、农业生态、环境生态等领域先进科研仪器推广及前沿技术咨询服务。美国PP SYSTEMS、英国HANSATECH公司中国总部美国SPECTRUM、美国WESCOR、意大利LSI等公司中国销售代表。
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